HBV RNA一直是近年来热度不减的新指标，其直接反映cccDNA转录活性的特点为慢乙肝患者疾病的用药疗效监测和治愈评判都带来了新的启发和指导。目前商品化的HBV RNA定量检测主要分为2种方法：SAT和PCR法。SAT以其“靶向提取、靶向扩增”的特点直接对HBV RNA进行精准定量，整个过程无需使用DNA酶、排除DNA干扰，以高灵敏度和高准确性备受关注。

而PCR方法则需要通过DNA酶处理以解决样本中DNA干扰问题，众多专家认为，DNA酶的处理可能是影响PCR法灵敏度的一个重要因素。由Vietnam Military Medical University团队研发的一种新型“一步法” RT-PCR方法（检测下限为100 copies/mL），可以在HBV DNA存在的情况下选择性的扩增并且定量HBV RNA，在不使用DNA酶的条件下解决DNA的干扰问题。

在该团队的研究中指出，HBV rcDNA和HBV RNA同时存在于患者血清中，而且rcDNA的含量很可能比RNA更高。因此，准确的RNA的定量要求不能存在rcDNA的干扰。然而，目前传统PCR方法使用DNA酶处理rcDNA的这个步骤不仅会造成RNA的损失、还会使得rcDNA除不干净，进而让定量结果的不准确。

此外，该团队还发现存在高浓度HBV rcDNA的样本中没有HBV RNA的情况，这样的样本假设使用传统DNA酶处理的方式，极其容易造成没除干净的rcDNA被当作RNA进行扩增，使得阴性样本假阳，严重影响临床对患者病情的诊断。

因此，在该团队所研发的这种新技术中，用到了一种比较特别的、用于逆转录的引物，叫做“HBV-RT” 引物（图1），3′端的序列与HBV RNA是完全互补的，而5'端的核苷酸尾部与HBV RNA是不相关的。这个不相关的5' 端会与得到的逆转录产物cDNA进行耦合，以这种方式，PCR可以选择性只扩增这个跟HBV-RT 引物5' 端耦合的cDNA，避免去扩增体系中的双链DNA。这个HBV-RT引物 3′端的priming序列设计得很短，只有10个核苷酸长度，熔化温度 (Tm) 约为 40 °C，这足以启动单链 HBV RNA 模板上的逆转录步骤形成cDNA产物。而双链的HBV rcDNA则不会跟HBV-RT 引物结合（图2）。

图1：HBV RT 引物序列

图2：新型RT-PCR扩增HBV RNA原理

研究数据进一步指出该新型方法的性能参数优越，定量范围从100 copies/mL至2*10^6 copies/mL，以上结果显示该新型方法学灵敏度较好，下限低至100 copies/mL。

目前已上市的HBV RNA商品化检测试剂盒中，无需DNA酶处理的SAT方法检测下限为50 copies/mL，需要使用DNA酶处理的PCR方法检测下限为300 copies/mL，而该项研究在去除DNA酶处理的操作后，将PCR法的检测下限提升至100 copies/mL，这给PCR方法的HBV RNA检测试剂带来了新的希望，也给还未上市的在研试剂带来了探索新思路。总之，对于HBV RNA的定量，要达到的目标是，即使存在过量 HBV DNA，也不会影响到其准确的定量结果，使其成为监测 cccDNA转录活性和评估治疗效果的有效工具。

仁度生物自主研发的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒，以其独特的检测技术、高灵敏性和高特异性等特点率先获准上市。区别于传统的PCR技术，本试剂盒采用独特的SAT技术，即RNA实时荧光恒温扩增扩增技术，能对RNA分子进行直接扩增和定量，不受样本中的HBV DNA干扰，无需DNA酶处理，检测下限低至50 copies/mL，搭载AutoSAT全自动平台，消除手工操作误差、节约实验室人力物力，为乙肝患者保驾护航。